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Neomers

An innovative new approach to aptamer selection that overcomes the problems associated with SELEX.  Découvrez ce qui rend les Neomers uniques dès maintenant, ou contactez directement notre équipe pour découvrir comment cela peut bénéficier à votre application unique.

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Qu'est-ce que SELEX?

SELEX stands for Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment. It is a technique used to identify and isolate specific nucleic acid molecules, such as DNA or RNA aptamers, that can bind to a target molecule with high affinity and specificity.

Le processus SELEX implique plusieurs cycles itératifs de sélection et d'amplification, où un pool diversifié de molécules d'acides nucléiques est exposé à la molécule cible. Après chaque cycle, les molécules d'acides nucléiques liées sont séparées de celles non liées, puis les molécules liées sont amplifiées par réaction de polymérase en chaîne (PCR) ou par réaction de transcription inverse PCR (RT-PCR) pour la SELEX basée sur l'ARN.

Pendant les cycles suivants, les conditions de sélection deviennent plus strictes pour enrichir les molécules d'acides nucléiques
acides nucléiques qui ont la plus grande affinité pour la cible. À mesure que le processus se poursuit, le pool de
aptamères devient de plus en plus enrichi en ceux qui peuvent se lier efficacement à la cible, conduisant à l'isolement d'aptamères spécifiques avec de fortes affinités de liaison.

SELEX sequences

Qu'est-ce que SELEX?

SELEX signifie Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment. Il s'agit d'une technique utilisée pour identifier et isoler des molécules spécifiques d'acides nucléiques, telles que les aptamères d'ADN ou d'ARN, qui peuvent se lier à une molécule cible avec une grande affinité et spécificité.

Le processus SELEX implique plusieurs cycles itératifs de sélection et d'amplification, où un pool diversifié de molécules d'acides nucléiques est exposé à la molécule cible. Après chaque cycle, les molécules d'acides nucléiques liées sont séparées de celles non liées, puis les molécules liées sont amplifiées par réaction de polymérase en chaîne (PCR) ou par réaction de transcription inverse PCR (RT-PCR) pour la SELEX basée sur l'ARN.

Pendant les cycles suivants, les conditions de sélection deviennent plus strictes pour enrichir les molécules d'acides nucléiques
acides nucléiques qui ont la plus grande affinité pour la cible. À mesure que le processus se poursuit, le pool de
aptamères devient de plus en plus enrichi en ceux qui peuvent se lier efficacement à la cible, conduisant à l'isolement d'aptamères spécifiques avec de fortes affinités de liaison.

SELEX sequences

Le problème avec SELEX est la région aléatoire.

 La figure suivante montre une bibliothèque classique de sélection d'aptamères SELEX. 

SELEX aptamer sequence

La séquence aléatoire dans la bibliothèque initiale est composée de 40 nucléotides, ce qui signifie qu'il existe 1,24 E24 séquences possibles. La nature continue de la région aléatoire impose une contrainte sur la diversité structurelle. Il est nécessaire d'avoir au moins trois nucléotides pour former une boucle. En conséquence, la séquence aléatoire doit être de 40 nt afin d'obtenir une couverture adéquate de la diversité structurelle. SELEX commence avec une aliquote de la bibliothèque aléatoire synthétisée représentant 1E15 séquences. Il s'agit du nombre maximum de séquences qui peuvent être appliquées expérimentalement. Cela représente un très petit sous-ensemble des 1,2E24 séquences possibles dans la bibliothèque synthétisée, ce qui entraîne deux contraintes.

1. Chaque sélection commence avec des séquences complètement différentes.

2. Chaque séquence dans la bibliothèque de départ est présente en moyenne en tant que copie unique. 

Commencer la sélection avec une seule copie de chaque séquence signifie que plusieurs cycles de sélection itérative doivent être effectués pour enrichir le nombre de copies des séquences qui se lient à la cible. Cela semble bien, mais commencer avec une seule copie de chaque séquence signifie également que la majorité des séquences sont perdues de manière arbitraire (qu'elles se lient ou non) lors du premier cycle de sélection. 

1E15 séquences sont un si petit sous-échantillon des séquences possibles qu'il est acquis qu'il n'y aura pratiquement aucune superposition de séquences d'une aliquote de la bibliothèque à une autre. En conséquence, il n'est pas possible de répliquer la sélection des mêmes séquences sur différentes cibles. Nous et d'autres avons tenté de résoudre ce problème en utilisant une sélection négative contre des contre-cibles où nous éliminons les séquences qui se lient à d'autres cibles. Cela fonctionne bien pour les séquences qui réagissent fortement, mais cela ne fonctionne pas bien pour les séquences qui réagissent faiblement.   

SELEX Selection Schematic

Le problème avec SELEX est la région aléatoire.

 La figure suivante montre une bibliothèque classique de sélection d'aptamères SELEX. 

SELEX aptamer sequence

La séquence aléatoire dans la bibliothèque initiale est composée de 40 nucléotides, ce qui signifie qu'il existe 1,24 E24 séquences possibles. La nature continue de la région aléatoire impose une contrainte sur la diversité structurelle. Il est nécessaire d'avoir au moins trois nucléotides pour former une boucle. En conséquence, la séquence aléatoire doit être de 40 nt afin d'obtenir une couverture adéquate de la diversité structurelle. SELEX commence avec une aliquote de la bibliothèque aléatoire synthétisée représentant 1E15 séquences. Il s'agit du nombre maximum de séquences qui peuvent être appliquées expérimentalement. Cela représente un très petit sous-ensemble des 1,2E24 séquences possibles dans la bibliothèque synthétisée, ce qui entraîne deux contraintes.

1. Chaque sélection commence avec des séquences complètement différentes.

2. Chaque séquence dans la bibliothèque de départ est présente en moyenne en tant que copie unique. 

Commencer la sélection avec une seule copie de chaque séquence signifie que plusieurs cycles de sélection itérative doivent être effectués pour enrichir le nombre de copies des séquences qui se lient à la cible. Cela semble bien, mais commencer avec une seule copie de chaque séquence signifie également que la majorité des séquences sont perdues de manière arbitraire (qu'elles se lient ou non) lors du premier cycle de sélection. 

1E15 séquences sont un si petit sous-échantillon des séquences possibles qu'il est acquis qu'il n'y aura pratiquement aucune superposition de séquences d'une aliquote de la bibliothèque à une autre. En conséquence, il n'est pas possible de répliquer la sélection des mêmes séquences sur différentes cibles. Nous et d'autres avons tenté de résoudre ce problème en utilisant une sélection négative contre des contre-cibles où nous éliminons les séquences qui se lient à d'autres cibles. Cela fonctionne bien pour les séquences qui réagissent fortement, mais cela ne fonctionne pas bien pour les séquences qui réagissent faiblement.   

SELEX aptamer sequence

Pourquoi est-ce vraiment un problème?

Les protéines abondantes dans le sang, comme l'albumine sérique humaine, sont présentes à une concentration de 600 µM. Si votre cible est présente dans le sang à une concentration de 600 pM, il y a une différence d'un million de fois. Les aptamères doivent avoir une affinité un million de fois plus grande pour votre cible que pour l'ASA. Les anticorps ont cette affinité, résultant de la tolérance immunitaire dans leur développement. Il n'est pas possible d'obtenir ce niveau de spécificité avec la contre-sélection des aptamères. C'est pourquoi les aptamères ont bien fonctionné dans des publications contre des cibles en tampon, mais pas bien contre les mêmes cibles dans des matrices complexes représentées par des fluides biologiques.

Pourquoi est-ce vraiment un problème?

Les protéines abondantes dans le sang, comme l'albumine sérique humaine, sont présentes à une concentration de 600 µM. Si votre cible est présente dans le sang à une concentration de 600 pM, il y a une différence d'un million de fois. Les aptamères doivent avoir une affinité un million de fois plus grande pour votre cible que pour l'ASA. Les anticorps ont cette affinité, résultant de la tolérance immunitaire dans leur développement. Il n'est pas possible d'obtenir ce niveau de spécificité avec la contre-sélection des aptamères. C'est pourquoi les aptamères ont bien fonctionné dans des publications contre des cibles en tampon, mais pas bien contre les mêmes cibles dans des matrices complexes représentées par des fluides biologiques.

C'est pourquoi les aptamères ont échoué jusqu'à présent dans les applications commerciales.

La méthode Neomer surmonte ces contraintes:

We designed the Neomer selection method to overcome the difficulties implicit with SELEX. One core insight that enables the Neomer method was that it was possible to generate a library of sequences that maintains the same level of structural diversity as a contiguous 40 nt random region in a SELEX library by interspersing sixteen random nucleotides in between fixed sequences. The fixed sequences in our libraries are designed such that they do not hybridize with each other. Secondary structure in the library is driven by the identity of the non-contiguous random nucleotides. A library with 14 random nucleotides consists of 2.68E8 possible sequences. We start selection with these libraries with 2.68E12 sequences, thus obtaining an average of 10,000 copies of each sequence at the start of selection. This eliminates the risk of arbitrarily losing good sequences in the first round of selection. This also enables us to characterize the effect of selection in a single selection round. 

Neomer Selection Schematic

C'est pourquoi les aptamères ont échoué jusqu'à présent dans les applications commerciales.

La méthode Neomer surmonte ces contraintes:

Nous avons conçu la méthode Neomer pour surmonter les difficultés inhérentes à SELEX. Un aperçu fondamental qui permet la méthode Neomer était qu'il était possible de générer une bibliothèque de séquences qui maintient le même niveau de diversité structurelle qu'une région aléatoire continue de 40 nt dans une bibliothèque SELEX en intercalant seize nucléotides aléatoires entre des séquences fixes. Les séquences fixes dans nos bibliothèques sont conçues de manière à ne pas s'hybrider entre elles. La structure secondaire de la bibliothèque est déterminée par l'identité des nucléotides aléatoires non contigus. Une bibliothèque avec 16 nucléotides aléatoires se compose de 4,29E9 séquences possibles. Nous commençons la sélection avec ces bibliothèques contenant 4,29E12 séquences, obtenant ainsi en moyenne 1 000 copies de chaque séquence au début de la sélection. Cela élimine le risque de perdre arbitrairement de bonnes séquences lors du premier cycle de sélection. Cela nous permet également de caractériser l'effet de la sélection en un seul cycle de sélection. 

Graphical representation or diagram illustrating the steps of the Neomer method.
Neomer method

Transforming Aptamer Development from being an Art to Science

We have detailed how a library of 2.68E8 unique sequences can be applied across various targets, enabling us to apply the same starting library to each target with only a single round of selection. In practice, we conduct selection in triplicate for each target as well as for a negative control. By assessing the counts of each unique sequence, we can explore the structure space to identify which structures show enrichment within the positive target library.

The Neomer approach leverages advanced statistical methods to improve the efficiency and reliability of the selection process and select the top performing structures from the selected library. Central to this analysis are the enrichment metrics: target and counter-target averages, log-transformed ratios, and other statistical metrics such as p-values. These parameters allow for a nuanced assessment of aptamer specificity and performance across various selection conditions. By comparing these metrics between different selections, we can identify structures that demonstrate consistent enrichment for the target of interest while maintaining low affinity for counter-targets, achieving unprecedented levels of specificity. An example would include screening against common-counter targets such as abundant blood proteins like HSA and IgG. Further steps are then taken to characterize sequences enriched per selected structure. This approach creates an in silico immune tolerance system for aptamer development. Such specificity is critical for the success of aptamers in commercial applications.

The Neomer approach represents the next generation of aptamer development, elevating it from an empirical process to a scientifically rigorous and highly precise methodology.

Une deuxième idée clé a été le développement d'un processus qui nous permettrait de caractériser l'ensemble des 4,29E9 séquences en une seule analyse de séquençage de nouvelle génération. Nous obtenons en moyenne de 10 à 20 millions de lectures par bibliothèque avec le séquençage Illumina NovaSeq. Ce n'est pas suffisant pour assurer la couverture de l'ensemble des séquences de la bibliothèque. Pour surmonter cette contrainte, nous avons intégré un site de restriction au milieu de la bibliothèque. Après la sélection et l'amplification, nous utilisons ce site pour diviser la bibliothèque en deux parties (modules), chacune contenant huit nucléotides aléatoires. Chaque module se compose de 65 536 séquences possibles. Nous obtenons une couverture de l'ensemble des séquences possibles dans chaque module avec 10 millions de lectures en NGS. Ensuite, nous multiplions les fréquences observées dans le module A avec celles observées dans le module B pour chaque bibliothèque sélectionnée. Cette matrice de produits ou carré de Punnett contient les fréquences de toutes les 4,29E9 séquences.

 

Module A&B

Transformer le développement des aptamères en une science

Nous avons expliqué comment nous pouvons appliquer le même ensemble de 4,29E9 séquences à différentes cibles et
caractériser l'effet d'un seul cycle de sélection sur chaque séquence. En pratique, nous utilisons cette capacité pour effectuer une sélection sur chaque cible en triplicata et sur un témoin négatif en triplicata. Nous avons développé un logiciel sur nos propres serveurs Linux qui nous permet de déterminer les moyennes et les écarts-types de ces moyennes pour chacune des 4,29E9 séquences pour chaque traitement. Nous comparons ensuite les moyennes positives aux moyennes négatives et développons une matrice de 4,29E9 valeurs Z. Notre logiciel génère les 10 000 meilleures séquences en fonction du score Z.

Neomer Photo Website-1

Nous avons également développé un logiciel qui nous permet de vérifier les performances des 10 000 meilleures séquences
les séquences sélectionnées pour votre cible dans la sélection contre d'autres cibles telles que les protéines abondantes dans le sang comme HSA et IgG. Nous filtrons les séquences qui se lient bien à votre cible et ne sélectionnons que celles qui ne montrent aucune réponse à ces contre-cibles comme candidats. De cette manière, nous parvenons à obtenir des niveaux de spécificité inégalés. En effet, nous avons créé un système de tolérance immunitaire in silico pour le développement des aptamères. Ce niveau de spécificité est nécessaire pour que les aptamères réussissent dans les applications commerciales. C'est pourquoi nous considérons l'approche Neomer comme le prochain niveau et la génération future de tout le développement des aptamères.

In Silico Aptamer Selection Options

NeoVentures now provides additional project options with In Silico aptamer selection, offering significant cost savings compared to our traditional custom aptamer design process. Learn more about our In Silico solutions today!

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Opportunités de licence

Nous avons décidé de mettre la bibliothèque Neomer à disposition sous forme de licence pour les laboratoires ayant la capacité de réaliser la sélection en interne. Cette voie offre des économies substantielles par rapport à notre conception traditionnelle d'aptamères personnalisés. En savoir plus sur les licences.

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Regardez la présentation du Dr. Gregory Penner

Neomers:
Une méthode reproductible de sélection d'aptamères

Cette conférence a eu lieu le 4 avril lors d'Aptamers 2022.

Le Dr. Gregory Penner a introduit notre nouvelle méthode révolutionnaire de sélection d'aptamères. Écoutez ce qu'il a à dire à ce sujet en regardant la présentation complète.

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Cette conférence a eu lieu le 4 avril lors d'Aptamers 2022.

Le Dr. Gregory Penner a introduit notre nouvelle méthode révolutionnaire de sélection d'aptamères. Écoutez ce qu'il a à dire à ce sujet en regardant la présentation complète.

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