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Neomers

An innovative new approach to aptamer selection that overcomes the problems associated with SELEX.  Explora qué hace único a Neomers ahora, o ponte en contacto directamente con nuestro equipo para descubrir cómo puede beneficiar a tu aplicación única.

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Qué es SELEX?

SELEX stands for Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment. It is a technique used to identify and isolate specific nucleic acid molecules, such as DNA or RNA aptamers, that can bind to a target molecule with high affinity and specificity.

El proceso SELEX implica varias rondas iterativas de selección y amplificación, donde un conjunto diverso de moléculas de ácidos nucleicos se expone a la molécula objetivo. Después de cada ronda, las moléculas de ácidos nucleicos unidas se separan de las no unidas, y luego las moléculas unidas se amplifican mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o PCR de transcripción inversa (RT-PCR) para SELEX basado en ARN.

Durante las rondas posteriores, las condiciones de selección se vuelven más rigurosas para enriquecer los ácidos nucleicos.
moléculas de ácido nucleico que tienen la mayor afinidad por el objetivo. A medida que el proceso continúa, el conjunto de
aptámeros se enriquece cada vez más para aquellos que pueden unirse efectivamente al objetivo, lo que lleva al aislamiento de aptámeros específicos con fuertes afinidades de unión.

SELEX sequences

Qué es SELEX?

SELEX significa Selección Evolutiva Sistemática de Ligandos mediante Enriquecimiento Exponencial. Es una técnica utilizada para identificar y aislar moléculas específicas de ácidos nucleicos, como los aptámeros de ADN o ARN, que pueden unirse a una molécula objetivo con alta afinidad y especificidad.

El proceso SELEX implica varias rondas iterativas de selección y amplificación, donde un conjunto diverso de moléculas de ácidos nucleicos se expone a la molécula objetivo. Después de cada ronda, las moléculas de ácidos nucleicos unidas se separan de las no unidas, y luego las moléculas unidas se amplifican mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o PCR de transcripción inversa (RT-PCR) para SELEX basado en ARN.

Durante las rondas posteriores, las condiciones de selección se vuelven más rigurosas para enriquecer los ácidos nucleicos.
moléculas de ácido nucleico que tienen la mayor afinidad por el objetivo. A medida que el proceso continúa, el conjunto de
aptámeros se enriquece cada vez más para aquellos que pueden unirse efectivamente al objetivo, lo que lleva al aislamiento de aptámeros específicos con fuertes afinidades de unión.

SELEX sequences

El problema con SELEX es la región aleatoria.

 La siguiente figura muestra una biblioteca de selección de aptámeros SELEX clásica. 

SELEX aptamer sequence

La secuencia aleatoria en la biblioteca inicial está compuesta por 40 nucleótidos, lo que significa que hay 1.24 E24 secuencias posibles. La naturaleza contigua de la región aleatoria impone una restricción en la diversidad estructural. Se necesita al menos tres nucleótidos para formar un asa. Como tal, la secuencia aleatoria debe ser de 40 nt para proporcionar una cobertura adecuada de la diversidad estructural. SELEX comienza con una porción de la biblioteca aleatoria sintetizada que representa 1E15 secuencias. Este es el número máximo de secuencias que se pueden aplicar experimentalmente. Esto representa un subconjunto muy pequeño de las posibles 1.2E24 secuencias en la biblioteca sintetizada, lo que resulta en dos restricciones.

1. Cada selección comienza con secuencias completamente diferentes.

2. Cada secuencia en la biblioteca inicial está presente en promedio como una única copia. 

Comenzar la selección con una sola copia de cada secuencia significa que se deben realizar varias rondas de selección iterativa para enriquecer el número de copias de aquellas secuencias que se unen al objetivo. Esto suena bien, pero comenzar con una sola copia de cada secuencia también significa que la mayoría de las secuencias se pierden arbitrariamente (ya sea que se unan o no) en la primera ronda de selección. 

1E15 secuencias es una muestra tan pequeña de las secuencias posibles que es un hecho que prácticamente no habrá superposición de secuencias de una porción de la biblioteca a otra. Como tal, no es posible replicar la selección de las mismas secuencias en diferentes objetivos. Nosotros y otros hemos intentado superar este problema utilizando selección negativa contra objetivos contrarios, donde descartamos secuencias que se unen a otros objetivos. Esto funciona bien para secuencias que tienen una reactividad cruzada fuerte, pero no funciona bien para secuencias con reactividad cruzada débil.   

SELEX Selection Schematic

El problema con SELEX es la región aleatoria.

 La siguiente figura muestra una biblioteca de selección de aptámeros SELEX clásica. 

SELEX aptamer sequence

La secuencia aleatoria en la biblioteca inicial está compuesta por 40 nucleótidos, lo que significa que hay 1.24 E24 secuencias posibles. La naturaleza contigua de la región aleatoria impone una restricción en la diversidad estructural. Se necesita al menos tres nucleótidos para formar un asa. Como tal, la secuencia aleatoria debe ser de 40 nt para proporcionar una cobertura adecuada de la diversidad estructural. SELEX comienza con una porción de la biblioteca aleatoria sintetizada que representa 1E15 secuencias. Este es el número máximo de secuencias que se pueden aplicar experimentalmente. Esto representa un subconjunto muy pequeño de las posibles 1.2E24 secuencias en la biblioteca sintetizada, lo que resulta en dos restricciones.

1. Cada selección comienza con secuencias completamente diferentes.

2. Cada secuencia en la biblioteca inicial está presente en promedio como una única copia. 

Comenzar la selección con una sola copia de cada secuencia significa que se deben realizar varias rondas de selección iterativa para enriquecer el número de copias de aquellas secuencias que se unen al objetivo. Esto suena bien, pero comenzar con una sola copia de cada secuencia también significa que la mayoría de las secuencias se pierden arbitrariamente (ya sea que se unan o no) en la primera ronda de selección. 

1E15 secuencias es una muestra tan pequeña de las secuencias posibles que es un hecho que prácticamente no habrá superposición de secuencias de una porción de la biblioteca a otra. Como tal, no es posible replicar la selección de las mismas secuencias en diferentes objetivos. Nosotros y otros hemos intentado superar este problema utilizando selección negativa contra objetivos contrarios, donde descartamos secuencias que se unen a otros objetivos. Esto funciona bien para secuencias que tienen una reactividad cruzada fuerte, pero no funciona bien para secuencias con reactividad cruzada débil.   

SELEX aptamer sequence

Por qué es realmente un problema?

Las proteínas abundantes en la sangre como la albúmina sérica humana están presentes a una concentración de 600 μM. Si tu objetivo está presente en la sangre a una concentración de 600 pM, esto representa una diferencia de un millón de veces. Los aptámeros necesitan tener una afinidad un millón de veces mayor por tu objetivo que por la albúmina sérica humana. Los anticuerpos tienen esto, como resultado de la tolerancia inmunológica en su desarrollo. No es posible obtener este nivel de especificidad con la selección contraria con aptámeros. Por eso, los aptámeros han funcionado bien en publicaciones contra objetivos en búfer, pero no tan bien contra los mismos objetivos en matrices complejas representadas por fluidos biológicos.

Por qué es realmente un problema?

Las proteínas abundantes en la sangre como la albúmina sérica humana están presentes a una concentración de 600 μM. Si tu objetivo está presente en la sangre a una concentración de 600 pM, esto representa una diferencia de un millón de veces. Los aptámeros necesitan tener una afinidad un millón de veces mayor por tu objetivo que por la albúmina sérica humana. Los anticuerpos tienen esto, como resultado de la tolerancia inmunológica en su desarrollo. No es posible obtener este nivel de especificidad con la selección contraria con aptámeros. Por eso, los aptámeros han funcionado bien en publicaciones contra objetivos en búfer, pero no tan bien contra los mismos objetivos en matrices complejas representadas por fluidos biológicos.

Por eso los aptámeros han fracasado hasta la fecha en aplicaciones comerciales.

El método Neomer supera estas limitaciones:

We designed the Neomer selection method to overcome the difficulties implicit with SELEX. One core insight that enables the Neomer method was that it was possible to generate a library of sequences that maintains the same level of structural diversity as a contiguous 40 nt random region in a SELEX library by interspersing sixteen random nucleotides in between fixed sequences. The fixed sequences in our libraries are designed such that they do not hybridize with each other. Secondary structure in the library is driven by the identity of the non-contiguous random nucleotides. A library with 14 random nucleotides consists of 2.68E8 possible sequences. We start selection with these libraries with 2.68E12 sequences, thus obtaining an average of 10,000 copies of each sequence at the start of selection. This eliminates the risk of arbitrarily losing good sequences in the first round of selection. This also enables us to characterize the effect of selection in a single selection round. 

Neomer Selection Schematic

Por eso los aptámeros han fracasado hasta la fecha en aplicaciones comerciales.

El método Neomer supera estas limitaciones:

Diseñamos el método de selección Neomer para superar las dificultades implícitas con SELEX. Una idea central que permite el método Neomer fue que era posible generar una biblioteca de secuencias que mantuviera el mismo nivel de diversidad estructural que una región aleatoria contigua de 40 nt en una biblioteca SELEX al intercalar dieciséis nucleótidos aleatorios entre secuencias fijas. Las secuencias fijas en nuestras bibliotecas están diseñadas de manera que no hibriden entre sí. La estructura secundaria en la biblioteca está determinada por la identidad de los nucleótidos aleatorios no contiguos. Una biblioteca con 16 nucleótidos aleatorios consta de 4.29E9 secuencias posibles. Comenzamos la selección con estas bibliotecas con 4.29E12 secuencias, obteniendo así un promedio de 1,000 copias de cada secuencia al inicio de la selección. Esto elimina el riesgo de perder arbitrariamente buenas secuencias en la primera ronda de selección. Esto también nos permite caracterizar el efecto de la selección en una sola ronda de selección. 

Graphical representation or diagram illustrating the steps of the Neomer method.
Neomer method

Transforming Aptamer Development from being an Art to Science

We have detailed how a library of 2.68E8 unique sequences can be applied across various targets, enabling us to apply the same starting library to each target with only a single round of selection. In practice, we conduct selection in triplicate for each target as well as for a negative control. By assessing the counts of each unique sequence, we can explore the structure space to identify which structures show enrichment within the positive target library.

The Neomer approach leverages advanced statistical methods to improve the efficiency and reliability of the selection process and select the top performing structures from the selected library. Central to this analysis are the enrichment metrics: target and counter-target averages, log-transformed ratios, and other statistical metrics such as p-values. These parameters allow for a nuanced assessment of aptamer specificity and performance across various selection conditions. By comparing these metrics between different selections, we can identify structures that demonstrate consistent enrichment for the target of interest while maintaining low affinity for counter-targets, achieving unprecedented levels of specificity. An example would include screening against common-counter targets such as abundant blood proteins like HSA and IgG. Further steps are then taken to characterize sequences enriched per selected structure. This approach creates an in silico immune tolerance system for aptamer development. Such specificity is critical for the success of aptamers in commercial applications.

The Neomer approach represents the next generation of aptamer development, elevating it from an empirical process to a scientifically rigorous and highly precise methodology.

Una segunda idea clave fue el desarrollo de un proceso que nos permitiera caracterizar todas las 4.29E9 secuencias en un solo análisis de secuenciación de nueva generación. Obtenemos un promedio de 10 a 20 millones de lecturas por biblioteca con la secuenciación Illumina NovaSeq. Esto no es suficiente para cubrir todas las secuencias de la biblioteca. Para superar esta limitación, hemos construido un sitio de restricción en el medio de la biblioteca. Después de la selección y amplificación, usamos este sitio para dividir la biblioteca en dos partes (módulos), cada una conteniendo ocho nucleótidos aleatorios. Cada módulo consta de 65,536 secuencias posibles. Obtenemos cobertura de todas las secuencias posibles en cada módulo con 10 millones de lecturas en NGS. Luego, multiplicamos las frecuencias observadas en el módulo A con las observadas en el módulo B para cada biblioteca seleccionada. Esta matriz de productos cruzados o cuadro de Punnett contiene las frecuencias de todas las 4.29E9 secuencias.

 

Module A&B

Mover el Desarrollo de Aptámeros a Ser una Ciencia

Hemos explicado cómo podemos aplicar el mismo conjunto de 4.29E9 secuencias a diferentes objetivos y
caracterizar el efecto de una sola ronda de selección en cada secuencia. En la práctica, utilizamos esta capacidad para realizar una selección en cada objetivo en triplicado y en un control negativo en triplicado. Hemos desarrollado software en nuestros propios servidores Linux que nos permite determinar los promedios y las desviaciones estándar de estos promedios para cada una de las 4.29E9 secuencias para cada tratamiento. Luego comparamos los promedios positivos con los promedios negativos y desarrollamos una matriz de 4.29E9 valores Z. Nuestro software muestra las 10,000 principales secuencias según el puntaje Z.

Neomer Photo Website-1

También hemos desarrollado software que nos permite evaluar el rendimiento de las 10,000 mejores
secuencias seleccionadas para tu objetivo en la selección contra otros objetivos como las proteínas abundantes en la sangre como la HSA y la IgG. Filtramos las secuencias que se unen bien a tu objetivo y seleccionamos como candidatas solo aquellas que no muestran respuesta a estos objetivos contrarios. De esta manera, podemos obtener niveles de especificidad sin precedentes. En efecto, hemos creado un sistema de tolerancia inmunológica in silico para el desarrollo de aptámeros. Este nivel de especificidad es necesario para que los aptámeros tengan éxito en aplicaciones comerciales. Es por eso que consideramos el enfoque Neomer como el próximo nivel y la próxima generación de todo el desarrollo de aptámeros.

In Silico Aptamer Selection Options

NeoVentures now provides additional project options with In Silico aptamer selection, offering significant cost savings compared to our traditional custom aptamer design process. Learn more about our In Silico solutions today!

APRENDE MÁS AHORA

Oportunidades de Licencia

Hemos decidido poner la biblioteca Neomer disponible para licenciamiento a laboratorios que tengan la capacidad para realizar la selección internamente. Este camino ofrece ahorros sustanciales sobre nuestro diseño tradicional de aptámeros personalizados. Obtén más información sobre licencias.

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Mira la presentación del Dr. Gregory Penner

Neomers:
Un Método Reproducible de Selección de Aptámeros

Esta conferencia tuvo lugar el 4 de abril en Aptámeros 2022.

El Dr. Gregory Penner presentó nuestro revolucionario nuevo método de selección de aptámeros. Escucha lo que tiene que decir al ver la presentación completa.

Complete el formulario para acceder de inmediato.

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Neomers:
Un Método Reproducible de Selección de Aptámeros

Esta conferencia tuvo lugar el 4 de abril en Aptámeros 2022.

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